식품미생물학 4강 미생물 생육과 생육에 영향을 미치는 요인Ⅱ
1. 미생물의 생육곡선
생물의 생장 (growth)
미생물은 그 크기가 작아서 세포 수 측정함으로써 생장 측정
미생물의 증식을 측정할 때는 보통 회분배양 (batch culture) 방식 이용
일정량의 배양액이 담긴 밀폐된 배양용기에 미생물 배양하는 방법 배양 중
: 미생물 개체 수↑ , 영양물질↓ , 배양생성물↑
생육곡선
회분배양 조건에서 배양시간의 경과에 따라 세포 수를 측정해 나타낸 그래프 S 자를 옆으로 눕혀 놓은 형태
생육단계별 특성
(1) 유도기 (lag phase)
미생물을 새로운 배양액에 접종하면
세포가 즉시 증가하지 않고 , 일정 시간 적응기간 가짐
증식을 위해 필요한 효소 , 리보솜 , 핵산과 같은 분자들 합성 , 에너지 생성
균의 종류나 배지의 상태 , 배양 조건에 따라 다름
(2) 대수기 (exponential, log phase)
세포가 일정 비율로 분열 . 생균 수가 대수적으로 증가
세대시간 (generation time) 이 전 배양 기간 중 가장 짧고 일정 물리·화학적 처리에 민감
: 항생물질과 같은 화학물질에 가장 민감 : 열처리나 소독제 처리로 쉽게 사멸 영양증식기 (trophophase)
: 일차 대사물질 (primary metabolite) 생산하는 시기 ( 단백질 , 핵산 만들기 위한 아미노산 , 뉴클레오타이드 합성 )
(3) 정지기 (stationary phase)
산소와 영양분 고갈 . 용존산소 부족 . 유해물질이 축적 . 자라는 세포 수 ≒ 죽는 세포 수 .
생균 수가 일정하게 유지 세포 수는 최고에 도달
영양분 결핍 & 노폐물 축적 ⇒ 내생포자 형성
세포벽과 세포막 조성에 변화 ⇒ 화학물질 또는 방사선에 내성 특이생산기 (idiophase)
: 다른 효소와 단백질을 만들기 시작해 항생제와 같은 새로운 이차 대사물질 (secondary metabolite) 생산
(4) 사멸기 (death phase)
자라는 세포. 죽는 세포는 ⇒ 생균 수 줄어드는 시기
영양소 결핍 , 유해 대사물 축적과 같이 생장 환경이 더욱 악화 세포가 자가분해 (autolysis) 하면서
대수적 사멸 자가분해 (autolysis)
미생물 세포가 죽은 후 세포 내 효소 작용에 의해 세포 내 여러 물질들이 분해되는 현상
소나 생선류의 경우 죽은 후 자가분해에 의해 근육이 연화 . 단백질 분해효소 , 핵산 분해효소 , 지방 분해효소의 작용
⇒ 아미노산 , 지미성분의 핵산 분해물 , 지방산과 글리세롤 (glycerol)
2. 미생물의 생육도 측정법
1 간접적 방법
(1) 균체량 측정법
배양액을 여과 또는 원심분리하여 상등액을 제거한 후
미생물만 분리 회수하여 젖은 상태 그대로 무게를 측정 ( 습량 )
or 수분을 건조시킨 후 균체 무게를 측정 ( 건량 )
장점
: 간단하고 비교적 정확
: 광학적 방법으로 측정하기 어려운 경우 유용 ( 곰팡이 , 방선균 )
단점
: 시간이 많이 걸리고 정밀한 검량이 어려움
(2) 균체질소량 측정법
켈달법 (Kjeldahl determination): 미생물마다 일정량의 단백질을 함유하고 있으므로
단백질을 구성하 고 있는 질소 측정
질소량은 미생물 종류와 상태 , 배양 조건 등에 따라 변하므로
일정한 조건에서 자란 동일 미생물 의 경우에만 사용
(3) 광학적 측정법
미생물이 증가할수록 배양액의 탁도가 증가한다는 원리 분광광도계 (spectrophotometer)
: 현탁 세포 (cell suspension) 에 의해 산란되는 빛의 분산도 ( 현탁 도 , turbidity) 를
측정함으로써 생체량의 상대적 증가 관찰
(4) 세포 내 대사물질의 상대적 측정법
세포 내에 일정량을 함유하고 있는 핵산량 , ATP 등을 생화학적으로 분석 ⇒ 세포량을 상대적으로 측정
2. 미생물의 생육도 측정법
2 직접적 방법
(1) 직접계수법
< 페트로프 - 하우저 계수기 >
혈구계수기 (hemocytometer) 또는 페트로프 - 하우저 (Petroff-Hausser) 계수기
→ 단위면적에 존재하는 세포 수를 현미경으로 관찰 , 측정 → 초기 시료 내의 총균 수를 환산하여 계산
장점: 조작이 쉽고 간편 . 결과를 단시간에 얻을 수 있음
단점: 세균의 사멸 여부와 관계없이 시료 내 모든 세균 수를 측정
: 시료 수가 많으면 조작이 지루함 : 측정하는 사람에 따라 오차가 심함
(2) 생균 수 측정법 (viable cell count)
① 도말평판법 (spread plate method)
적절히 희석된 시료의 일정량을 고체배지 표면에 유리봉을 이 용하여 균일하게 도말하여 배양
→ 생육한 집락 (colony) 수 측정하여 희석배율 곱하여 측정 단점
: 결과를 얻기까지 오랜 시간이 걸림
: 1 개의 집락이 반드시 1 개의 세포에서 이루어졌다고 단정하기 어려움 : 혐기성균의 경우 , 혐기적 환경에서 배양하여 생균 수 측정
2 직접적 방법
(2) 생균 수 측정법 (viable cell count)
② 주입평판법 (pour plate method)
적절히 희석된 시료 일정량 + 액상의 고체 영양배지 (45~55 ° C) → 혼합물을 멸균된 평판배지 위에 부어 굳힘
→ 배양한 후 배지상의 집락 수를 측정하여 희석배율 곱함
배지상의 집락은 30~300 개 가 되도록 시료를 희석
단점
: 45 ° C 정도에서 배지가 굳기 전에 플레이트에 부어 시료와 섞으므로 일부 저온균의 경우 손상될 수 있음
미생물의 생육도 측정법
2 직접적 방법
(2) 생균 수 측정법 (viable cell count)
③ 막여과법 (membrane filtration method)
미생물은 통과하지 못하는 여과막 (0.22~0.45 μm ) 사용 → 미생물을 여과지 위에 농축
→ 여과지를 배지 위에 올려놓고 일정시간 배양 , 집락 수 측정 액체 양은 많으나 미생물 수가 적은
음용수의 일반세균 및 대장균군 검사에 사용
액체 중 잔유물이 많으면 배양 후 미생물 군집 계측에 방해가 되므로 시료는 반드시 투명한 액체여야 함
④ 최확수법 (most probable number, MPN)
동일한 배지가 담긴 3 개 또는 5 개 시험관을 세 세트 준비
각 세트에 10 배씩 희석된 시료
(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를 접종해 배양 최확수 통계표에 의해 생균 수를 추정 수질 검사나 음료의 미생물 검사에 이용
3.배지 (medium)
: 미생물 성장에 필요한 영양분을 함유하고 있는 것
조성은 미생물마다 다름
미생물의 분리 , 동정 , 항생제 감수성 조사 등에 사용 필요 이상의 영양분은 오히려 미생물 성장을 억제
영양분 종류에 따른 배지
(1) 자연배지 (natural medium)
감자 , 우유 , 토마토액과 같이 자연산물로 미생물을 배양하는 배지
(2) 인공배지 ( 합성배지 , synthetic medium)
여러 가지 영양성분을 넣어 만든 배지 제한배지 (defined medium)
: 화합물 종류 및 농도를 정확히 알고 제조
복합배지 (complex medium) : 화합물 조성을 모름
[ex. 펩톤 (peptone), 효모 추출물 (yeast extract)]
단순배지 : 배지에 넣어 준 유기물 종류가 적음
2 사용 목적에 따른 배지
(1) 일반영양배지 (general nutrient medium)
모든 생육인자를 포함한 영양물질 함유 대다수의 세균 , 효모 , 곰팡이를 배양
(2) 선택배지 (selective medium)
특정한 미생물 성장만을 도모하기 위해
특별한 영양물질 ( 항생제 , 염료 , 탄소원 ) 을 포함시켜 만든 배지
원하는 미생물만 선택적으로 배양 가능
(3) 분별배지 ( 감별배지 , differential medium)
배지에 특수한 생화학적 지시약을 넣어 줌으로써
한 종류의 미생물을 다른 종류의 미생물과 구별할 수 있게 함
Eosin-methylene blue(EMB) 배지 : 유당을 발효시켜 산을 생산하는 균은 금속성 녹색 광택 이 있는 집락 형성
(4) 강화배지 ( 증식배지 , enrichment medium)
여러 미생물이 혼합되어 있을 경우
원하는 미생물의 증식을 도모하는 영양분을 넣어 준 배지 배지에 혈액을 넣어 준 혈액영양배지
: 병원성 세균의 증식이 활발하여 쉽게 분리
3 물리적 성상에 따른 배지
(1) 액체배지 (liquid medium, broth)
배지에 한천을 첨가하지 않은 액체 상태의 배지 미생물의 증식 , 당 분해 시험 ,
미생물의 생화학적 성상 검사 , 대사산물 검출에 사용
(2) 고체배지 (solid medium)
배지를 고형화시키기 위해 액체배지에 한천을 첨가한 배지 집락의 형태 관찰 , 생균 수 측정 , 장기보관에 이용
고체배지의 종류
① 평판배지 (plate medium)
: 페트리접시에 고체배지를 15~20mL 정도 붓고 ( 두께 약 4mm) 굳힌 것
[ 미생물의 분리 배양 , 집락 관찰 , 용혈능 및 항생제 감수성 검사 등에 사용 ]
② 사면배지 (slant medium)
: 시험관에 고체배지를 약 30 도 경사가 되도록 굳힌 것
[ 호기성 미생물의 증식 및 보존 , 세균의 생화학적 검사 등에 사용 ]
③ 천자배지 (stab medium)
: 시험관에 고체배지를 수직으로 세운 상태로 굳힌 것
[ 미호기성균이나 혐기성균의 배양 , 균주의 보존 , 세균의 운동성 시험 등에 사용 ]
3 물리적 성상에 따른 배지
(3) 반고체배지 (semisolid medium)
젤리 같은 반고형상의 배지로 0.3~0.5% 한천 함유 세균의 설탕 이용성이나 운동성을 관찰할 때 이용
4. 배양
자연계에서 다양한 기능을 하는 미생물이 필요할 때 이를 쉽게 이용하기 위해서는
미생물을 순수분리해서 생육시키는 배양기술 & 이를 보존하는 기술 필요
미생물을 분류하고 동정하기 위해서는 이미 정립된 배양조건을 적용 대사산물을 대량생산하기 위해서는 배양조건을 최적화
순수배양
코흐 (Robert Koch)
: 시료에서 특정 세균만 순수하게 분리해서 배양
: 순수배양 (pure culture) 기술 고안 한천배지상에서 하나의 세포가 증식해 육안으로도 관찰할 수 있는 집락 형성
→ 동일한 세포에서 증식한 순수배양체
순수배양체 분리 방법
도말평판법
: 시료액을 적절히 희석한 후 0.1~ 0.2mL 를 굳힌 한천배지에 접종 → 멸균된 유리봉 (spreader) 으로 도말해서 배양
획선평판법 (streak plate method)
: 멸균된 백금이를 이용하여 시료를 취하고 한천 배지 위에 접종하여 획선 긋는 방법 : 1 차 획선 그은 후 백금이 멸균 . 1 차 획선의 접종원 (inoculum) 취하여 2 차 획선을 긋는 과정 반복 ⇒ 세포를 점차적으로 희석하면서 집락 형성
주입평판법
: 희석액 0.1~10mL 를 멸균된 배양접시에 담고 → 약 50 ° C 로 식힌 액체상 한천배지를 혼합
→ 세균이 퍼지도록 배양접시를 돌리면서 굳힌 후 배양
배양법
균주 특성에 따라
호기배양 : 산소를 주입해야 함 혐기배양 : 산소가 없음
배양연속성에 따라
회분배양 : 일정량의 배지를 이용해 단회 배양하는 닫힌계배양법 연속배양 : 배양 동안 일정 속도로 새로운 배지를 공급하고
같은 속도로 일부 배양액을 배출하는 열린계배양법
배지의 물리적 상태에 따라
고체배양 :
사면배양 (slant culture)
: 한천배지를 시험관에 부어 기울인 상태로 굳혀 표면적을 넓게 만든 사면 배지에 멸균된 백금이로 아래쪽에서 위쪽으로 가볍게 직선 또는 지그재그로 선 긋기해서 미생물을 접종하여 배양 : 호기배양
천자배양 (stab culture)
: 시험관 속의 고체배지에 백금이를 깊이 찔러 넣어 미생물을 접종해 배양 : 혐기배양
배지의 물리적 상태에 따라
액체배양
정치배양
: 배지를 움직이지 않은 채로 배양 : 표면배양
진탕배양
: 플라스크의 액체배지를 진탕해서 산소를 공급하는 배양
: 심부배양
통기교반배양
: 제균한 공기를 직접 주입하면서 진탕배양
: 심부배양
정리하기
미생물의 생육곡선은 새로운 배양액에 적응하는 기간인 유도기, 세포가 일정 비율로 분열하여 대수적으로 증가하는 시기인 대수기, 생육하는 세포 수와 사멸하는 세포 수가 비슷하여 생균 수가 일정하게 유지되는 시기인 정지기, 생육 세포가 줄어들고 사멸 세포 수가 증가하여 생균 수가 줄어드는 사멸기로 구분된다.
미생물의 생육도 측정법에는 간접적 방법인 균체량 측정법, 균체질소량 측정법, 광학적 측정법, 세포 내 대사물질의 상대적 측정법과 직접적 방법인 직접계수법, 생균 수 측정법이 있다.
미생물의 생장에 사용되는 배지는 영양분 종류에 따라 자연배지, 인공배지로 구분되며, 사용 목적에 따라 일반영양배지, 선택배지, 분별배지, 강화배지로 구분된다.
독일의 세균학자 코흐는 시료에서 특정 세균만 순수하게 분리해서 배양하는 순수배양 기술을 고안함으로써 미생물학의 진보에 크게 기여했다. 순수배양체를 분리하는 방법에는 도말평판법, 획선평판법, 주입평판법이 있으며 세균은 한천배지상에서 하나의 동일한 세포가 증식해 육안으로도 관찰할 수 있는 집락을 형성한다는 특성을 이용한 방법이다.
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